g-氨基丁酸(GABA)是哺乳动物中枢神经系统中重要的抑制性神经递质，在体内通过作用于离子通道型的GABAA、GABAC受体及代谢型的GABAB受体而发挥生理功能。GABAB 受体存在于神经元的突触前及突触后部位，介导慢的抑制性效应，在脑内参与许多重要的生理活动和病理变化，包括认知损害、癫痫、痉挛及药物成瘾等。GABAB受体属于G蛋白偶联受体家族的C家族，具有七次跨膜结构，N-端位于胞外，C-端位于胞内。GABAB受体有两个重要的结构域——胞外的捕蝇草模块(VFT，负责与GABA结合)及七次螺旋跨膜结构域 (HD，负责G蛋白的激活)。位于突触前的GABAB受体被激活后，主要通过偶联Gi/o-型蛋白而阻滞钙通道，减少钙内流，抑制兴奋性递质的释放；位于突触后膜的GABAB受体被激活后，可通过G蛋白偶联增强钾电导，增加钾外流。GABAB受体还可影响细胞内环磷酸腺苷(cAMP)的水平及细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)和cAMP反应原件连接蛋白(CREB)的磷酸化。功能状态的GABAB受体是由GB1和GB2形成的异源二聚体，GB1可与GABA结合，但它不能激活G蛋白，不仅如此，单独表达的GB1由于C-端存在胞内滞留信号(IRS)而不能定位至细胞膜；相反，GB2在与GB1形成二聚体后可激活G蛋白，但它没有结合GABA的能力；GB2还可增强激动剂与GB1的亲和力，并且通过与GB1形成二聚体结构而屏蔽GB1的胞内滞留信号，使其能定位至细胞膜。但迄今为止，细胞膜上GABAB受体的寡聚化对受体激活的影响还了解的不清楚。

 

ABPP (Activity-based protein profiling) 技术是运用明升手机合成的具有高选择性的分子探针(activity-based probe，ABP)对蛋白质的结构与功能进行研究的新型技术。它整合了生物学和明升手机学科的各自优势，以一种相对简单明了的方法在分子、细胞水平研究活性小分子与生物大分子之间的复杂相互作用，从而从分子水平揭示生物体在生理或病理状态下的关键调控机制。ABPP技术目前应用于对重要药物靶点蛋白质的结构与功能研究的主要方法之一。

 

为了研究GABAB受体在细胞中的定位及功能，明升中国app院上海药物研究所研究团队根据已知的GB1强亲和力、高选择性的拮抗剂CGP64213设计合成了活性导向的光亲和标记荧光探针分子probe 1，并用该探针探讨了过表达GABAB受体的CHO细胞中GABAB受体的细胞定位情况。Probe 1的结构包括3个功能部分：活性基团，即与CGP64213结构相同的部分，这部分结构负责与受体蛋白结合；三氟甲基偶氮烯光亲和标记基团，负责在探针分子与靶标蛋白结合后，通过紫外光照射在二者间引入共价键，增加标记的效率；BODIPY荧光基团，方便被标记蛋白的检测。活性测试的结果表明，probe 1因保持了CGP64213结构中对活性至关重要的部分而相应的保持了与GABAB受体的亲和力。由于二者之间的亲和力，probe 1可与GABAB受体特异性结合，紫外光照射活化探针分子中的光标记基团后可在二者之间引入共价键，受体蛋白被标记，通过探针分子结构中的荧光基团，可实现细胞状态下对GABAB受体的定位观测。荧光成像实验表明，probe 1在过表达GABAB受体的CHO细胞中特异性标记表达于细胞表面的GB1，这与文献报导的CGP64213是GB1选择性的拮抗剂相吻合。不仅如此，实验表明probe 1标记的特异性依赖于其结构中的活性基团，因为缺失结构中的活性基团将导致探针分子标记能力的丧失。同时，CGP64213预处理过的细胞将不能被probe 1标记，说明 probe 1不仅保持了CGP64213的活性，而且保持了其与受体蛋白间的作用模式。光亲和标记基团的引入对于提高标记的效率起了重要的作用，因为若在标记实验中省略光照射步骤，即不在探针分子与结合的受体蛋白间引入共价键，将导致观察到的荧光信号的明显减弱。 这些结果为利用小分子探针实现对活细胞中处于功能状态的GABAB受体的动态研究以及利用活性导向的蛋白质标记技术研究膜受体提供了可行性。

 

该研究工作由上海药物所南发俊课题组和华中科技大学明升m88app院刘剑峰教授课题组合作完成。论文以Letter形式发表在《明升手机版明升手机杂志》（Journal of Medicinal Chemistry） 上。（来源：明升中国app院上海药物研究所）