“咔嚓、咔嚓……”

app家利用基因“魔剪”在特定DNA部位切开口子，对基因组进行编辑。

自2012年6月CRISPR-Cas9技术诞生后，这项被称为“基因剪刀”的革命性技术被用于植物育种、癌症治疗等各个领域，成为全球实验室里最风靡的基因编辑技术。它还以迅雷不及眼耳之势斩获2020年的诺贝尔明升手机奖。

“CRISPR-Cas系统是微生物中广泛存在的抗病毒免疫系统——约90%的古菌和40%的细菌基因组中存在这一系统。”中科院微生物所研究员向华在接受《明升中国app报》采访时说。那么，这种系统如何在微生物中广泛存在并发挥作用？是否有一些“暗物质”在维持这一系统的稳定性？

经过近7年的研究，向华与微生物所研究员李明及合作者找到了保护微生物CRISPR-Cas系统的“暗物质”。相关研究4月30日发表于《app》。

微生物免疫“分子警察”

“实际上，‘基因剪刀’这一革命性的生物技术起源于app家对微生物中一种特殊的免疫系统的研究，即CRISPR-Cas。”该研究共同第一作者兼通讯作者李明对《明升中国app报》说。

据介绍，CRISPR-Cas系统是在微生物中广泛存在的抗病毒（噬菌体）免疫系统。宿主菌通过将入侵病毒的特定DNA序列插入到其CRISPR结构中，可形成对该病毒的永久性“记忆”。这些记忆性DNA序列可经转录加工产生小分子RNA，它们携带了病毒的序列信息，能够指导CRISPR效应蛋白（如Cas9蛋白、Cascade蛋白复合物）特异性识别和切割再次入侵的病毒DNA，实现对该病毒的适应性免疫。

“如果将CRISPR结构比作记录了病毒DNA这种‘犯罪分子’信息的档案库，那么CRISPR效应蛋白就像一些‘分子警察’，手持写有病毒序列特征的批捕文件（crRNA）在细胞内寻找并消灭‘犯罪分子’（病毒DNA）。”李明解释说。

对此，向华表示，CRISPR-Cas系统的维持和表达往往消耗大量的物质和能量，给宿主细胞造成一定的负担，同时它也有发生“自免疫”的风险，即杀死宿主细胞。因此在进化过程中，细菌可能会丢弃这个系统。

那么，是什么在维持CRISPR-Cas系统在微生物中的广泛稳定性呢？微生物基因组中是否存在一类对其具有保护功能的“暗物质”？这是微生物学家长期关注却尚未充分回答的前沿app问题。

经过反复的猜测和试错验证，研究团队发现，“保护”微生物CRISPR-Cas系统的“暗物质”的是一对RNA分子。

“自私”的护卫

向华和李明团队是较早从事CRISPR免疫机制研究的国内团队。早在2014年，他们利用一株名为西班牙盐盒菌的古菌及其病毒，系统解析了CRISPR高效获取病毒DNA序列信息的分子机制。

研究过程中，他们发现了一个奇怪的现象：CRISPR效应蛋白的编码基因（Cas5/6/7/8）无法逐一敲除，但可以作为整体一起敲除，从而推测“分子警察”Cas的基因簇中可能隐藏了一个“细胞成瘾”元件。“也就是说，有一些‘暗物质’让细胞对CRISPR-Cas蛋白上瘾，没有这些蛋白，宿主细胞就会“瘾发身亡”。李明解释说。

那么，为了查明“暗物质”的身份，经过近7年的探索，他们在Cas的基因簇附近发现了一类由两个小RNA组成的全新的毒素-抗毒素系统，并将两个小RNA分别命名为毒素（CreT）和抗毒素（CreA）。他们发现这一对神秘小RNA通过一系列十分精巧的分子机制守护了CRISPR-Cas系统的结构和功能。

“我们发现，当毒素-抗毒素系统与CRISPR-Cas偶联存在时，Cas效应蛋白可以和抗毒素共同抑制毒素的表达，而一旦Cas效应蛋白被破坏，就会释放毒素表达并杀死细胞。”李明说。

他进一步解释，这说明CRISPR-Cas系统效应蛋白在细胞中具有双重生理功能，它们一部分扮演着“分子警察”的角色，携带写有病毒序列信息的批捕文件，寻找入侵的病毒DNA并将其消灭；而另一部分效应蛋白则手持“抗毒素”控制器，守护在定时炸弹“毒素”基因旁边，一旦CRISPR-Cas系统丢失或被病毒破坏，它们就引爆炸弹，炸毁细胞中关键的蛋白质合成机器，使细胞休眠甚至死亡。

“CRISPR系统的这种貌似‘自私’的特性，使我们能够从更高纬度上认识微生物的免疫策略。”向华补充说。在自然界中，微生物往往以群体的形式存在，当某个细胞的CRISPR系统被病毒破坏时，很容易沦为病毒大量复制和增殖的病毒工厂，可以产生成百上千的子代病毒侵染群体中的其他细胞。而当CRISPR内置了毒素—抗毒素RNA系统，一旦CRISPR效应物被病毒破坏，就会毁掉病毒复制和增殖所必需的细胞机器，从而保护群体中其他细胞不被侵染，因此，这是一种利他主义的群体防御策略。

“这项研究中描述的发现无疑是新奇而有趣的。”一位审稿人在同行评议中表示。其他审稿人也表示，“这绝对是一项好研究”“代表了一个令人兴奋的发现和令人信服的想法”。

打开了解RNA“暗物质”新窗口

据该研究共同第一作者、微生物所博士后龚路遥介绍，此前，app家已发现6类毒素-抗毒素分子对，其中毒素均为蛋白质。这是研究人员首次在RNA层面发现毒素和抗毒素分子对。

“由于缺乏保守的序列特征，非编码RNA的预测和功能研究是非常困难的。但实际上，越来越多证据表明，非编码RNA在细胞明升m88活动中发挥非常重要的功能。”龚路遥说，这些RNA被称为基因组中的“暗物质”。

该团队还发现，在不同古菌、细菌不同类型的 CRISPR-Cas系统中，存在的毒素—抗毒素类似物在序列上非常丰富多样，蕴藏了大量未知机制的功能性小RNA。“这将为原核微生物‘非编码RNA暗物质世界’的研究打开一道宝贵的窗口，这些丰富多样的‘暗物质’的深入发掘将进一步推动生物技术的发展，包括对未来小RNA肿瘤药物、新型抗生素的研制等或将具有重要的启发意义。”向华说。

“这是一项十分优秀的研究，即使在CRISPR领域之外也很重要，有助于我们理解病毒防御和基因调控的共进化这一重要命题。”美国国立卫生研究院生物技术信息中心教授Eugene Koonin为能够参与这项“激动人心”的工作而感到兴奋。

相关论文信息：http://doi.org/10.1126/science.abe5601