韩春雨 图片来自网络
河北科技大学韩春雨在8月8日更新了实验操作细节，来自丹麦奥胡斯大学的蔡宇伽（）根据新旧版本，两次试图重复实验，然而都以失败告终。
近日，蔡宇伽向澎湃手机版（www.thepaper.cn）分享了他的实验过程，他表示愿意实名聊聊他的困惑。9月7日，蔡宇伽把韩春雨课题组论文中关于Figure4（图4）的疑惑，邮件给《自然-生物技术》的编辑。
《自然-生物技术》的主编Andrew Marshall回复了蔡宇伽，感谢他对韩春雨课题组论文中图4的关注，并对他根据论文进行重复实验遭遇困难表示遗憾。Andrew Marshall表示，杂志编辑们将会综合他们收到的关于NgAgo实验的其他材料，一起讨论。
蔡宇伽是来自明升中国的丹麦奥胡斯大学博士后，他先后师从Jacob Mikkelsen 和Soren Paludan教授，研究方向是开发基因治疗相关技术，包括病毒载体、基因编辑工具以及利用基因编辑工具研究免疫学问题，曾以第一作者身份在《eLIFE》期刊发表两篇论文。
NgAgo技术是一门崭新的基因编辑技术，由河北科技大学副教授韩春雨课题组5月2日在《自然-生物技术》上发表。NgAgo是“Natronobacterium gregoryi Argonaute”的简称，也就是来自格氏嗜盐碱杆菌的核酸内切酶。它不同于Argonaute（Ago）家族诸多需要高温的酶，能在37摄氏度常温下进行操作。这使得它能够和当今最为时兴的“基因魔剪”CRISPR-CAS9一起，共同效力于“编辑”目标基因，实现对特定DNA片段的敲除、加入等。论文发表4个多月后，因多个实验室表示无法重复实验，NgAgo技术受到质疑。
两次尝试重复实验失败，蔡宇伽说，“这是我个人的例子，但是不能证明这个不能重复，还需要更多的人做实验，公开数据。”他还提到：“app家是有义务去公开数据，让别人去重复。我个人认为，app是站在别人的肩膀上，同时你也要愿意成为别人肩膀，这样app才能进步。”
蔡宇伽第一次重复NgAgo实验，是在韩春雨将实验所需的质粒上传到非营利性质粒共享信息库Addgene后不久，蔡宇伽在一个基因上尝试了NgAgo系统，没有成功。
第二次，根据韩春雨8月8日上传的新版实验方法，在人类细胞上，蔡宇伽“完整”、“严格”地按照实验方法来做，“我不能保证条件是完全一样的，是按实验室条件最大程度地接近”。在蔡宇伽使用了两种不同的转染方法（Lipofectamine 2000和钙磷法）后，结果是“都没有看到NgAgo有活性，而CRISPR都是有效的。”在明升手机版(明升中国)的博客上，蔡宇伽分享了自己第二次重复实验时的T7EI结果图。
蔡宇伽第二次尝试重复实验的T7EI结果图。来源：蔡宇伽博客。
值得一提的是，蔡宇伽公布的实验结果和相关数据，是为数不多针对韩春雨新版实验方法而做出的。8月17日，日本东京都明升手机版app研究所（Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science）PI（项目负责人）Yuichiro Miyaoka和澳大利亚app家盖坦·布尔焦都在个人推特上公布了自己最新的实验结论——无法重复。但Yuichiro Miyaoka和盖坦·布尔焦都告诉澎湃手机版（www.thepaper.cn），他们的结果是根据韩春雨在《自然-生物技术》上的实验操作进行，并非是更新的版本。
对于实验所需的时间，蔡宇伽说最关键的实验所需要的时间是5天左右。此前，韩春雨曾对质疑声在论文发表后不到一个月就出现表示过疑问，他认为一个月“实验还没做完一轮”。进行过重复实验但未成功的盖坦·布尔焦和德国癌症研究中心的博士生Jan Winter都分别告诉过澎湃手机版（www.thepaper.cn），做完一次完整的NgAgo实验所需的时间。盖坦·布尔焦表示至少需要2-3个月。Jan Winter则表示，就他而言，全职做实验无需耗费一个月时间。澎湃手机版向蔡宇伽询问，为何盖坦·布尔焦所需时间较长，蔡宇伽认为，这是因为盖坦·布尔焦是在受精卵上做实验，要“复杂一点”。
韩春雨曾表示，80%的NgAgo重复实验失败是因为污染。为了确认自己的实验没有污染，蔡宇伽把自己实验所用的细胞送到德国GATC公司检测是否有支原体污染，检测结果显示细胞是干净的。
蔡宇伽把细胞送检德国GATC公司后的结果。来源：蔡宇伽博客。
“他新的protocol主要是强调几点：1.EDTA会影响NgAgo的活性。2.镁离子有辅助作用，会帮助NgAgo保持活性。3.保证没有污染。”蔡宇伽解释说，他的重复实验排除了EDTA和支原体污染，但仍不成功，也有可能是有一些其他不确定因素。在明升手机版(明升中国)的博客上，蔡宇伽分析这些不确定因素包括：“用的是实验室现有的DNAase/RNAase-free的水，不确定PH是多少；也没有荧光标记的ssDNA，不知道gDNA转染效率怎样；也没有来得及用Fragment analyzer看看的gDNA的纯度怎样。”
蔡宇伽还透露说，重复不出的并不只是自己，“我们那个系，也有人重复了，用他们合成的NgAgo，试了韩的以及除了韩之外的方法，还试了各种方法，比如转染，还把NgAgo做成病毒，感染细胞，但是也没有成功。”
但蔡宇伽也强调：“谁也没法说这是真是假。我个人是做了重复实验，但是没有重复出来。如果有忽视的地方，也完全有可能。但至少说明，NgAgo没有那么好做。”
尽管韩春雨本人也多次公开表示，目前的NgAgo尚不稳定，有不完善的地方，但蔡宇伽的困惑是，韩春雨发表在《自然-生物技术》的论文中说，NgAgo和CRISPR-Cas9一样高效。澎湃手机版（www.thepaper.cn）查阅发现，韩春雨论文原文中写道：“NgAgo-gDNA 和Cas9-sgRNA在切割哺乳动物基因组DYRK1A位点的效率上是可以媲美的，NgAgo是31.97%，Cas9是32.2%（原文：NgAgo-gDNA and Cas9-sgRNA cleaved this locus with comparable efficiencies（Fig. 4e, 31.97% for NgAgo vs. 32.2% for Cas9））。”
“《Nature》的要求比较高，效率越高越好，这可能导致一些研究者做一些夸大。”蔡宇伽说。
蔡宇伽研读过韩春雨课题组发表在《自然-生物技术》上的论文，他还表达了一些困惑。
首先是被认为最有难度、也最关键的Figure4（图四），蔡宇伽说“我个人认为，图有点自我矛盾。”他找出电脑中已经下载好的论文，一一指给澎湃手机版：“Fig.4a各靶点之间最大相隔30个核苷酸，T7EI切割，跑胶之后，各产物条带大小一致。而在Fig.4e，Cas9靶点和NgAgo靶点部分重合，相距小于30个核苷酸，但却看到了两者产物条带的明显偏移。另一个奇怪的地方是，Fig.4e里NgAgo两个产物条带分别小于对应的Cas9产物，而在Fig.4f里NgAgo的两个产物条带大小却和对应的Cas9产物一致。”
“另外一个比较困惑的地方，根据补充材料Supplementary table 2,GATA4基因的PCR扩增产物应该是705bp，而在fig.4f却是稍大于750bp。” 蔡宇伽补充道。
韩春雨课题组论文中的Figure4。来源：韩春雨课题组论文《DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute》。
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