上月25号的Nature刊登的一篇论文，首次用显微镜的方式实时观测到了艾滋病病毒在胞膜诞生的过程。关于这项工作，国内媒体纷纷以"app实验首次见证艾滋病毒的诞生"等标题有所报道，但可惜报道中没有解释前因后果，有的地方也表达得不准确，使得这项重要的app突破与大众的距离非但没有拉近，反而更远、变得更加神秘了。因此，我反复阅读了其科研论文，并采访了做出这一发现的app家们。这里试作一app小品，希望对广大读者有所裨益。
HIV病毒（俗称的艾滋病病毒）是一个直径只有0.12微米的小球，而一般人体细胞的大小是20微米——这大概相当于（北京市——编者注）海淀区与整个明升中国的比例。它像一个小小的鸡蛋，而蛋黄里是个小小的RNA片段，储存着病毒的遗传信息。HIV病毒会选择性地侵入人体免疫系统，比如淋巴细胞内部，把自己的RNA片段反转录成DNA，继而整合进人体细胞的基因组里，潜伏下来。这一潜伏期可以长达十数年之久。在合适的条件下，这段潜伏的病毒DNA片段就会被激活，利用寄主细胞来生产其需要的病毒蛋白及RNA。
app家们利用最新的单病毒追踪（single virus tracking）技术，使病毒蛋白发出荧光，已经能够对上述侵入以及细胞内运输的过程进行实时监测。但对于最后的关键一步，也就是病毒蛋白在哪里、以及如何组装成新的病毒个体，还没有很好的研究手段。近日，美国洛克菲勒大学的app家们成功克服了这一技术难题，并实时见证了HIV病毒的诞生。其相关研究手机版，已经提前刊登在世界权威学术杂志《自然》5月25日的网络版上。
很多年来，虽然没有太多的数据支持，学界还是普遍认为HIV病毒个体是在细胞膜表面被组装的，但最近，人们在细胞内的多囊泡体（Multi-Vesicular Bodies）中也发现了组装完毕的HIV病毒。“科研也是有跟风现象的，”文章的通讯作者之一，Simon教授告诉笔者，“所以，也同样是在没有充足证据的情况下，大家又都认为HIV病毒是在胞内完成组装，然后被分泌出胞外。”然而，Simon教授和他的同行们有着不同的解释。他们认为，之所以在胞内发现新病毒个体，也许是因为细胞的自我保护机制又把部分病毒吞回胞内。
这是有他们自己的理由的。在过去的15年里，Simon教授的实验室一直致力于显微技术的开发。如今这项技术的分辨率已经足以识别细胞膜表面的单个病毒，而利用这项技术，Jouvenet博士记录了超过2万个HIV病毒移出胞外的过程。如他们所料，所有这些病毒“看起来”都是先在胞膜上组装，然后脱离胞膜。从来没有一个例子是大批新病毒直接脱离胞膜。在发表于2006年PLOS杂志上的研究手机版里，他们描述了这一现象，并用不依赖于显微观测的细胞生化方法，定性地证实了新HIV病毒个体是在胞膜上进行组装。而接下来，他们想要进一步直接证明，在显微镜下看到的胞膜上的“那些荧光点”，就是正在组装的HIV病毒本身。两年后的今天，他们终于成功地做到了这一点。
他们的名字是：Nolwenn Jouvenet, Paul D. Bieniasz 和 Sanford M. Simon；他们的工具是：全内反射荧光显微镜(TIR FM)，荧光共振能量转移(FRET)，荧光光漂白恢复（FRAP）；他们的材料是：荧光HIV病毒蛋白，荧光CD63蛋白，二氧化碳，HeLa细胞。
先来一点点背景知识：HeLa细胞，来源于一名美国妇女（Henrietta Lacks，1951年死于癌症）的子宫颈癌细胞。一般正常细胞通常复制52次后，即到达所谓的Hayflick limit，便进入凋亡阶段，而Hela细胞却几乎是永生不死的，拥有无限的分裂能力。因此，它也是生物学研究中最常用的人体细胞株之一，
下面好戏开始：首先，app家们把绿色荧光蛋白GFP与HIV病毒的Gag基因融合在一起，然后，让这种改造过的发光HIV病毒去侵染HeLa细胞。因为由Gag基因制造的蛋白是构成HIV病毒的主要结构元件；所以，当新生的病毒蛋白（为了表达方便，不太严格一点，下面简称Gag蛋白）被制造出来时，在显微镜的视野中，它们便闪烁出绿色的荧光，有的被运输到细胞膜表面组装新的病毒，而大部分则充满了细胞内部。
前者就是要研究的对象了。这里用全内反射荧光显微镜来进行观察，就可以把后者发出的背景荧光过滤掉。这样，app家们发现在细胞膜表面，出现了两大类的团状绿色荧光点。其中一类主要出现在HIV侵染后5-6小时后，相当稳定，并且几乎不运动；而另一类则主要是在侵染后14-15小时，并且来也匆匆，去也匆匆。究竟哪一类才是组装中的新生病毒呢？抑或，两者都不是？
前面提到，寄主细胞会有最后的挣扎，把出现在膜表面的新生病毒吞进胞内，试图阻止它进一步扩散。而被内吞回去的病毒外面被裹上一层蛋白，形成胞内体。这些胞内体很多就连在细胞膜上，因此，观测到的荧光很有可能来自于它们。app家们想到一个办法，就是把胞内体上的一种蛋白（叫做CD63）也涂上红色荧光，结果发现，红色荧光与第二类绿色荧光类似，都是来去如风。因此，只有第一类团状绿色荧光点有可能是我们想要的。
如果真的是病毒组装的话， Gag蛋白之间一定会非常地接近；标记这个距离，就需要用到特殊的“生物尺”。这把尺子的学名，叫做“荧光共振能量转移（FRET）”技术。它的原理是“隔山打牛”，也就是，如果两个不同发色基团A和B足够接近，当激发基团A的时候，基团A会把能量高效地转移给B。这样造成的结果是：A发出的荧光将减弱，而主要发出的是B发出的荧光。而这其中的能量转移效率与A和B距离的6次方成反比。
好了，回到实际研究中来。于是，app家们把Gag蛋白连上两种荧光蛋白：一种绿色，另一种红色。在能激发绿色荧光的显微镜下观察，第一类荧光团慢慢出现了：一开始，它里面红绿荧光都有，并且慢慢增强；很快，红色荧光增强的速率超过了绿色荧光——荧光共振能量转移出现了——这结果表明，Gag蛋白之间的距离的确已经满足了组装病毒的要求！
病毒的组装一旦完成，就再有新的Gag蛋白继续加入进来。app家们观察到，第一类荧光团大约在半个小时内发光强度达到饱和，那么这是否意味着病毒的组装已经完成呢？这里大显身手的，是一种叫做“荧光光漂白恢复（FRAP）”的技术。它的原理是，某一区域的荧光分子，一旦被激光照射后，其明升手机结构被破坏，不再发出荧光，即所谓“光漂白”；但被照射区域则会随着周围荧光分子的进入而逐渐恢复荧光。实验结果发现，对于尚未达到饱和强度的荧光团，漂白后它很快会恢复荧光强度；而已经达到饱和强度的，漂白后却无法恢复原状了——病毒蛋白确已装卸就绪。
那么，如何判断新生的病毒是否已经脱离寄主细胞膜了呢？这里，app家作了一番推理：如果病毒已经脱离，那么它将不能再与寄主细胞质进行物质交换，如H+离子的交换；因此，人为地提高寄主细胞内H+浓度，将不会影响已经脱离的病毒内的H+浓度。因此，app家们设计了一个巧妙的实验：他们把Gag蛋白与一种只有在非酸性条件下才能发出荧光的蛋白结合，然后，突然提高环境中二氧化碳（CO2）的浓度，很快地，寄主细胞内所特有的碳酸酐酶（Carbonic anhydrase）会迅速催化以下反应：
导致胞内酸性增强。与此相对应地，大部分第一类荧光团都被熄灭了——他们是发育中的未成熟病毒，而剩下的依然发亮的少部分，则正是已经脱离膜表面的成熟HIV病毒！
通过这些手段，app家们观测了370个这样的第一类荧光团，即新生病毒，最终确信，每个病毒的组装过程平均需要8.5分钟，而大部分在5-6分钟之内就能完成。这是人类第一次在活体细胞表面能够定量地观测单个病毒的组装过程。而至此，在显微镜下观测病毒的整个生活史已经成为可能。
“生物真是奇妙的个体，而我们去探索这一奥秘的能力依然有限。最令我们兴奋，也是最有挫折感的，是我们事先对此一无所知。”Simon教授说，“我们不知道HIV病毒的组装会花多久：几个小时？十几分钟？几秒，甚至更短？我和Bieniasz教授、Jouvenet博士估计了各种可能性以及对应的实验手段。这可能听起来不太专业……然而，当我们在讨论这些的时候，我感觉自己就好像一个顽童，刚刚拿到了最新奇的玩具——这太有意思了！”
同行们对于这项工作最多的提问是什么呢？“很不谦虚地说，迄今为止没有问题，只有赞美。”Simon教授的得意之情溢于言表。那么，记者们问的最多的呢？“呃……它能治艾滋病吗？”教授有点郁闷。
“答案自然是否定的，至少孤立地来看。”Bieniasz教授补充说，“另一方面来讲，迄今为止还没有用来阻断HIV病毒组装的抗AIDS药物，但理论上，这不是不可能的。我们现在对这一过程了解得越多，就越有可能找到相应的办法。下一步，我们的研究重点将放在了解这些病毒蛋白组装到一起的机理，以及搞清楚HIV病毒最喜欢出现在胞膜的那些位置来进行组装。”